Epigentek：EpiNext CUT＆RUN快速套件

富集組蛋白或轉錄因子（TF）的復合DNA在體內，然后下一代測序提供了一個有利的工具，研究全基因組蛋白質-DNA相互作用。它允許分析與活細胞中DNA序列結合的特定蛋白質。這樣的分析要求該方法可靠地鑒定真正的靶蛋白富集區域，特別是來自有限的細胞樣品。這些樣品可以包括從組織中分離的稀有細胞群、從整個細胞群分選的特定細胞和原代培養的亞群細胞如胚胎細胞。此外，該方法應確保富集的DNA含有最少的背景，并且蛋白質-DNA結合區的作圖具有最小偏差和高分辨率。已經使用了很長一段時間來實現該目標的主要方法是染色質免疫沉淀，然后是測序（ChIP-Seq）。然而，ChIP的主要局限性在于，它需要1）大量的輸入材料，細胞或組織，以產生超過背景噪聲的足夠強的信號;和2）在初始固定步驟期間交聯。有幾種先進的方法可用于ChIP-Seq，具有減少的細胞數量或增加的分辨率。這些方法包括ChIP-exo和ChIPmentation。ChIP-exo提供了高分辨率的映射，但耗時并且需要充足的輸入細胞供應。雖然ChIP片段化使用轉座酶和測序相容的銜接子以使得能夠在ChIP過程中整合連接，但其遵循傳統上緩慢（2天）的ChIP程序并且不能實現高分辨率作圖。CUT RUN（Cleavage Under Target Release Using Nuclease）是為了將捕獲的靶蛋白/DNA復合物從有限的生物材料中釋放出來，用于蛋白質-DNA相互作用的作圖，它顯著提高了作圖分辨率。然而，CUT RUN需要昂貴的PA/Mnase融合蛋白，其具有顯著的A/T序列偏差，導致靶蛋白相互作用的DNA區域譜嚴重受MNase消化水平的影響。

據今年3月份發布在ResearchSquare的一項研究，佛羅里達的科學家使用CUT&RUN技術，建立了眼球晶狀體中HIF1α結合位點的全基因組圖，文章鏈接：https://assets.researchsquare.com/files/rs-247248/v1/83c34fd6-e42a-491b-8828-247ace7a4fb8.pdf?c=1631877386

我們知道，基因表達可以通過許多不同的機制進行調節，包括轉錄因子、組蛋白和其他DNA結合蛋白。繪制出DNA和蛋白質之間的相互作用圖譜，對于理解基因激活或抑制以及其他細胞過程至關重要。

傳統上，可以通過進行染色質免疫沉淀和測序(ChIP-seq)來分析這些相互作用。但是這種方法需要大量的起始材料才能產生足夠強的信號以消除背景噪聲，并且經常返回假陽性信號。同時，ChIP-seq還需要優化的超聲處理來破碎染色質，這可能非常耗時并可能導致樣品損失。

在最近的一項研究中，佛羅里達大西洋大學和國家糖尿病、消化和腎臟疾病研究所的科學家們利用CUT&RUN技術建立了一個功能性全基因組圖譜，該圖譜是一種稱為缺氧誘導因子的蛋白質復合物的特異性結合位點—HIF1α，位于人眼的晶狀體中。該團隊表示選擇CUT&RUN而不是ChIP-seq分析，是因為前者不需要DNA-蛋白質交聯。此外，與ChIP-seq相比，前者成功實驗所需的細胞計數極低。

正常而言，隨著出生后眼睛的發育，提供健康血液供應的血管隨著時間的推移開始萎縮。結果，眼睛中的氧氣含量穩步下降，造成缺氧環境。HIF1α作為一種蛋白質復合物，可調節身體對缺氧環境的反應，這意味著它可以在晶狀體細胞發育和體內平衡中發揮作用。

研究人員首先選擇培養10天左右的大的WhiteLeghorn雞胚胎中分離出晶狀體細胞。收獲的細胞用稱為DMOG的HIF1α激活劑處理4小時，并用ConA包被的磁珠固定細胞核。之后，樣品被分為兩組：一組用HIF1α抗體處理，另一組用IgG抗體處理。將pA/MNase添加到樣品中以啟動碎裂。這種融合蛋白在與感興趣的蛋白質相互作用的特定區域剪切DNA——在這種情況下，該蛋白質是HIF1α。通過向樣品中加入CaCL2溶液來激活MNase，將DNA片段釋放到上清液中。CUT&RUN片段用蛋白酶K處理1小時，然后分離DNA進行測序。

在HIF1α激活后，CUT&RUN在原代晶狀體細胞中鑒定了8000多種HIF1α-DNA特異性復合物。他們能夠使用ATAC-seq和RNA-seq驗證并完成結合位點的映射，這表明這些復合物中約有1200個緊密聚集在染色質可及區域。進一步的分析揭示了526個基因的激活或抑制，其中116個基因在轉錄起始位點10kB內顯示HIF1α結合位點。

該實驗中收集的數據有助于建立眼晶狀體中HIF1αDNA復合物的第一個功能圖，同時也強調了健康晶狀體發育對HIF1α的需求。最終，CUT&RUN技術的這種成功應用，有助于接下來的大量研究，重點是了解某些蛋白質可能對基因表達的作用。

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結果展示

EpiNext CUT＆RUN快速套件優勢：

1、高富集：使用獨特的核酸切割酶混合物，其具有低序列偏好，以同時片段化染色質并切割/去除靶蛋白/DNA復合物兩端的任何DNA序列，而不影響靶蛋白占據的DNA。富集的DNA 20 bp可被高效、快速地回收。因此，靶蛋白富集區域可以可靠地獲得和在高分辨率作圖中鑒定。

2、低輸入材料：穩健的無超聲破碎、未結合的DNA切割和免疫捕獲都在相同的單管中進行處理，具有珠上連接。該方法使用細胞和組織兩者，并且允許靶蛋白的最大降解保護，且樣品損失最小。因此，輸入細胞量可以少至500個細胞，或者染色質量可以低至0.1 ?g。

3、最小背景：原位切割靶蛋白質/DNA復合物的兩（2）末端中未結合的DNA序列使得免疫捕獲背景最小化，從而允許具有1000萬個讀段的測序數據分析<。

4、快速、簡化的程序：從細胞到文庫DNA的過程少于3小時。

5、非常方便：該套件包含切割運行每個步驟所需的所有組件&，從而使EpiNext?切割&運行快速套件最方便，結果可靠且一致。